Il virus schiumoso delle scimmie zoonotiche in Bangladesh riflette diversi modelli di trasmissione e coinfezione

Articolo completo Cifre e dati Riferimenti Citazioni Metriche Licenze Ristampe e permessi PDF Abstract I virus schiumosi delle scimmie (SFV) sono onnipresenti nei primati non umani (NHP). Come in tutti i retrovirus, la trascrizione inversa di SFV porta alla ricombinazione e alla mutazione. Poiché è stato dimostrato che più esseri umani sono stati infettati da SFV rispetto a qualsiasi altro virus trasmesso dalle scimmie, l'SFV è un modello potenzialmente potente per studiare la virologia e l'epidemiologia dei virus nell'interfaccia uomo/NHP. In Asia, la SFV è probabilmente trasmessa all'uomo attraverso morsi e graffi di macaco che si verificano nel contesto della vita quotidiana. Abbiamo analizzato più sequenze provirali dal gene gag SFV da uomini e macachi al fine di caratterizzare la trasmissione retrovirale all'interfaccia uomo/NHP in Bangladesh. Qui riportiamo le prove che gli esseri umani possono essere infettati contemporaneamente da più ceppi di SFV, con alcuni individui infettati sia da un ceppo di SFV autoctono che da un ceppo simile a SFV trovato nei macachi di un'altra area geografica. Questi dati, combinati con i risultati precedenti, suggeriscono che sia il movimento facilitato dall'uomo dei macachi che porta all'introduzione di ceppi non residenti di SFV che la ricombinazione retrovirale nei macachi contribuiscono alla diversità di SFV tra gli esseri umani in Bangladesh. trasmissione Introduzione I virus schiumosi (FV) sono una sottofamiglia di retrovirus ampiamente distribuiti negli ospiti vertebrati, inclusi primati non umani, gatti, mucche e cavalli.1 Meiering CD, Linial ML. Prospettiva storica dell'epidemiologia e dell'infezione del virus schiumoso. Clin Microbiol Rev2001;14:165-176. [Crossref], [Web of Science ®], [Google Scholar] Gli FV sono antichi virus esogeni che vengono trasmessi in modo efficiente tra host ma non è noto che causino malattie.2Switzer WM, Salemi M, Shanmugam Vet al.Ancient co-speiation of simian virus schiumosi e primati. Natura2005;434:376–380. [Crossref], [Web of Science ®], [Google Scholar] Sebbene sia quasi onnipresente nei primati non umani (NHP), il virus schiumoso delle scimmie (SFV) non è endemico nell'Homo sapiens. L'infezione zoonotica degli esseri umani con SFV è stata precedentemente rilevata in diversi paesi e in vari contesti di contatto interspecie, tra cui laboratori NHP e lavoratori dello zoo in Nord America, lavoratori del "tempio delle scimmie", proprietari di animali domestici e persone che vivono intorno ai macachi ruspanti nel sud e sud-est Asia e cacciatori di selvaggina in Africa centrale.3Gessain A, Rua R, Betsem E, Turpin J, Mahieux R.HTLV-3/4 e retrovirus schiumosi scimmieschi nell'uomo: scoperta, epidemiologia, trasmissione tra specie e virologia molecolare. Virologia2013;435:187-199. [Crossref], [Google Scholar]Ad oggi, la trasmissione da NHP a uomo di SFV è stata documentata in > 100 persone, molto più del numero di eventi di trasmissione tra specie per gli altri retrovirus noti trasmessi da NHP: virus dell'immunodeficienza delle scimmie , simian retrovirus D o virus linfotrofico delle cellule T delle scimmie. . Virologia2013;435:187-199. [Crossref], [Google Scholar],4Khabbaz RF, Heneine W, George JRet al.Infezione di un lavoratore di laboratorio con virus dell'immunodeficienza delle scimmie. N Engl J Med1994;330:172–177. [Crossref], [Google Scholar],5Lerche NW, Switzer WM, Yee JLet al.Evidenza di infezione da retrovirus di tipo D delle scimmie in persone professionalmente esposte a primati non umani. J Virol2001;75:1783–1789. [Crossref], [Google Scholar],6Switzer WM, Bhullar V, Shanmugam Vet al.Frequente infezione da virus schiumoso delle scimmie in persone professionalmente esposte a primati non umani. J Virol2004;78:2780–2789. [Crossref], [Web of Science ®], [Google Scholar],7Kalish ML, Wolfe ND, Ndongmo CBet al.Cacciatori dell'Africa centrale esposti al virus dell'immunodeficienza delle scimmie. Emerg Infect Dis2005;11:1928–1930. [Crossref], [Web of Science ®], [Google Scholar] Data l'elevata prevalenza di SFV nel NHP e la diversità e l'estensione dell'interfaccia tra uomo e NHP, si stima che a livello globale il numero di individui infetti possa raggiungere le decine di migliaia.8Engel G, Hungerford LL, Jones-Engel Let al.Valutazione del rischio: un modello per prevedere la trasmissione interspecie del virus schiumoso delle scimmie dai macachi (M. fascicularis) agli umani in un tempio delle scimmie a Bali, in Indonesia. Am J Primatol2006;68:934-948. [Crossref], [Google Scholar],9Switzer WM, Shaohua T, Ahuka-Mundeke Set al.Novel infezioni da virus schiumoso delle scimmie da più specie di scimmie nelle donne della Repubblica Democratica del Congo. Retrovirologia2012;9:100. [Crossref], [Google Scholar] Inoltre, i pochi studi longitudinali sugli esseri umani infetti da SFV suggeriscono che l'SFV non viene trasmesso da una persona all'altra.10 Boneva RS, Switzer WM, Spira TJet al. Caratterizzazione clinica e virologica dell'infezione umana persistente con scimmie virus schiumosi. AIDS Res Hum Retroviruses2007;23:1330-1337. [Crossref], [Web of Science ®], [Google Scholar] In quanto tale, la caratterizzazione dei fattori che influenzano la trasmissione zoonotica di SFV può fornire il miglior modello contemporaneo per comprendere come e perché alcuni virus NHP sono in grado di causare una prolungata -Trasmissione umana.Il nostro gruppo ha studiato l'interfaccia tra uomo e NHP in Bangladesh negli ultimi 6 anni, concentrandosi sulla trasmissione tra specie di agenti infettivi.11Oberste MS, Feeroz MM, Maher Ket al.Caratterizzare il panorama dei picornavirus tra i primati sinantropici non umani in Bangladesh, 2007-2008. J Virol2013;87:558–571. [Crossref], [Google Scholar],12Oberste MS, Feeroz MM, Maher Ket al.Infezioni da picornavirus acquisite naturalmente in primati non umani allo zoo di Dhaka. J Virol2013;87:572–580. [Crossref], [Google Scholar],13Karlsson EA, Engel GA, Feeroz MMet al.Infezione da virus dell'influenza nei primati non umani. Emerg Infect Dis2012;18:1672–1675. [Crossref], [Web of Science ®], [Google Scholar] Il Bangladesh è uno dei paesi più densamente popolati del mondo, con molte aree urbane situate all'interno o in prossimità di habitat NHP. Diversi taxa NHP sono originari del Bangladesh, con il macaco rhesus (Macaca mulatta) il più numeroso e ampiamente distribuito.14Hasan K, Aziz MA, Alam SMet al.Distribuzione dei macachi rhesus (Macaca mulatta) in Bangladesh: variazione interpopolazione nel gruppo dimensione e composizione. Primate Conserv2013;26:115-124. [Crossref], [Google Scholar] Mentre l'habitat forestale continua a diminuire, il piccolo ed ecologicamente flessibile rhesus prospera in habitat alterati dall'uomo, in particolare nelle aree in cui gli atteggiamenti culturali incoraggiano la loro tolleranza.15Feeroz MM, Soliven K, Small CTet al.Dinamiche della popolazione di macachi rhesus e virus schiumoso associato in Bangladesh. Emerg Microbes Infect2013;2:e29. [Taylor & Francis Online], [Google Scholar] Mentre il contatto tra umani e macachi rhesus avviene principalmente nelle comunità in cui i macachi sono liberi, si verifica anche nei santuari religiosi che sono diventati rifugi per macachi e attraverso il possesso di animali da compagnia. Inoltre, un popolo nomade, noto come Bade o Qalandar, ha viaggiato per secoli nella regione, guadagnandosi da vivere mettendo in scena spettacoli con macachi addestrati. A differenza dell'Africa, la caccia alle scimmie per la carne di animali selvatici è rara in Bangladesh, essendo confinata alle popolazioni indigene nelle aree dei Chittagong Hill Tracts che confinano con il Myanmar.16 Chowdhury MSH, Halim M, Miah Met al. Comunicazione di ricerca: utilizzo della biodiversità attraverso la raccolta di risorse faunistiche dalle foreste da parte di la tribù Mro nelle Chittagong Hill Tracts, Bangladesh. Int J Biodiversity Sci Manage2007;3:56-62. [Taylor & Francis Online], [Google Scholar]Si pensa che la trasmissione da NHP a uomo di SFV avvenga più comunemente attraverso i morsi. L'SFV si replica attivamente nelle mucose orali delle scimmie infette, raggiungendo alte concentrazioni nella saliva, dove è possibile rilevare facilmente genomici e mRNA.17Murray SM, Picker LJ, Axthelm MK, Linial ML. Bersagli tissutali espansi per la replicazione del virus schiumoso con virus dell'immunodeficienza delle scimmie. immunosoppressione indotta. J Virol2006;80:663-670. [Crossref], [Google Scholar] Tuttavia, si sa relativamente poco su come le caratteristiche dell'ospite o del virus influenzino la trasmissione di SFV. Anche i morsi gravi non provocano in modo affidabile infezioni.9Switzer WM, Shaohua T, Ahuka-Mundeke Set al.Novel infezioni da virus schiumoso delle scimmie da più specie di scimmie nelle donne della Repubblica Democratica del Congo. Retrovirologia2012;9:100. [Crossref], [Google Scholar] Al contrario, alcuni esseri umani con infezione documentata non ricordano un'esposizione significativa al tessuto NHP o NHP. Altre importanti questioni riguardanti la trasmissione e l'infezione zoonotiche di SFV rimangono irrisolte. Ad esempio, mentre il DNA provirale viene rilevato in modo persistente per decenni in alcuni esseri umani infetti da SFV; altri individui sviluppano anticorpi contro SFV senza DNA provirale rilevabile.3Gessain A, Rua R, Betsem E, Turpin J, Mahieux R.HTLV-3/4 e retrovirus schiumosi scimmieschi nell'uomo: scoperta, epidemiologia, trasmissione tra specie e virologia molecolare. Virologia2013;435:187-199. [Crossref], [Google Scholar] Resta da scoprire se alcuni individui eliminano l'infezione o se alcuni ceppi virali sono più capaci di persistere. Sono necessarie ulteriori ricerche per determinare se, analogamente a SIV/HIV, in cui la ricombinazione tra ceppi retrovirali in un nuovo ospite è stato un evento precursore dell'evoluzione dei virus pandemici, ci sono prove che gli SFV si ricombinano negli ospiti umani. Sono stati condotti pochi studi per determinare se la concentrazione di SFV nella saliva influenzi o meno la trasmissione zoonotica, o come la risposta immunitaria umana faciliti o prevenga l'infezione o la viremia continua (Soliven et al. e Matsen et al., non pubblicato). E mentre i dati raccolti in altre aree geografiche e altri contesti di contatto uomo-macaco hanno fornito informazioni su come le variabili demografiche e il comportamento dei macachi e umani contribuiscono alla probabilità di aggressione macaco su uomo, si sa relativamente poco su come queste variabili influenzano il retrovirale. trasmissione.18Fuentes A, Gamerl S. Partecipazione sproporzionata per classi di età/sesso in interazioni aggressive tra macachi dalla coda lunga (Macaca fascicularis) e turisti umani nella foresta delle scimmie di Padangtegal, Bali, Indonesia. Am J Primatol2005;66:197-204. [Crossref], [Google Scholar]Qui presentiamo i dati che descrivono le esposizioni umane ai macachi rhesus e l'infezione da SFV in diversi siti in Bangladesh e nei proprietari di scimmie. La maggior parte degli altri studi si è concentrata su una regione del gene pol (integrasi), che è altamente conservata e quindi potrebbe non rivelare la variazione di SFV riscontrata negli individui infetti di una specie. Abbiamo ottenuto più cloni da sangue intero e sequenziato una porzione del gene gag SFV, scelto su pol per rivelare una maggiore variazione genetica SFV e utilizzato i dati della sequenza per confrontare il virus trovato negli esseri umani con quello trovato nei macachi con cui interagiscono . Mostriamo che gli esseri umani possono essere infettati contemporaneamente da più ceppi di SFV; alcuni individui sono infettati sia da un ceppo SFV autoctono (originario dove trovato) sia da un ceppo simile a SFV trovato nei macachi di altre aree geografiche. L'aumento dell'età era un fattore di rischio significativo per la trasmissione zoonotica di SFV nell'uomo. Anche il sesso femminile e la religione indù possono essere associati a un aumento del rischio. Questi dati combinati con i nostri risultati precedenti15 Feeroz MM, Soliven K, Small CTet al. Dinamiche della popolazione dei macachi rhesus e del virus schiumoso associato in Bangladesh. Emerg Microbes Infect2013;2:e29. [Taylor & Francis Online], [Google Scholar] suggeriscono che il movimento facilitato dall'uomo dei macachi, le infezioni multiple da SFV e la ricombinazione retrovirale contribuiscono tutti alla diversità retrovirale in Bangladesh. MATERIALI E METODI Siti di studio e popolazioni La popolazione dello studio comprendeva 209 soggetti umani campionati in cinque comunità siti (Sylhet, Bormi, Dhamrai, Narayanganj e Charmaguria), nonché 13 proprietari di scimmie esibizionisti appartenenti a un gruppo nomade che mettono in scena spettacoli con i loro macachi addestrati. I siti della comunità sono stati istituiti nel 2007 in luoghi in cui i macachi vivono liberamente e dove i residenti erano disposti a partecipare a ricerche longitudinali sulla trasmissione interspecie di agenti infettivi. Abbiamo campionato opportunisticamente i proprietari di scimmie performanti, quando li abbiamo incontrati lungo il percorso da o verso i nostri siti di studio della comunità. Un'analisi della diversità di SFV tra le scimmie del Bangladesh è presentata nel nostro studio associato.15 Feeroz MM, Soliven K, Small CTet al. Dinamiche della popolazione dei macachi rhesus e del virus schiumoso associato in Bangladesh. Emerg Microbes Infect2013;2:e29. [Taylor & Francis Online], [Google Scholar] I dati di quello studio fanno anche parte del set di dati del macaco SFV studiato nel presente studio. Qui presentiamo una breve descrizione dei siti di campo (Figura 1) inclusi in questo studio. Il virus schiumoso delle scimmie zoonotiche in Bangladesh riflette diversi modelli di trasmissione e coinfezione Tutti gli autoriGregory A Engel, Christopher T Small, Khanh Soliven, Mostafa M Feeroz, Xiaoxing Wang, M Kamrul Hasan, Gunwha Oh, SM Rabiul Alam, Karen L Craig, Dana L Jackson, Frederick A Matsen IV, Maxine L Linial e Lisa Jones-Engelhttps://doi.org/10.1038/emi.2013.60Pubblicato online: 25 gennaio 2019Figura 1 Posizioni di campionamento e diversità dei ceppi di SFV rilevati in soggetti umani con infezione zoonotica. I soggetti umani sono stati intervistati e campionati in cinque siti urbani in tutto il Bangladesh dove i macachi rhesus erano liberi. Abbiamo recentemente dimostrato che in ciascuno di questi siti è possibile rilevare nei macachi un ceppo principale di SFV.15 Feeroz MM, Soliven K, Small CTet al. Emerg Microbes Infect2013;2:e29. [Taylor & Francis Online], [Google Scholar] I ceppi principali di Rhesus SFV sono codificati a colori su questa mappa. Per i soggetti umani (indicati con "BGH") che sono stati trovati infetti da SFV, abbiamo ottenuto più cloni da sangue intero e sequenziato una parte del gene gag SFV. I dati della sequenza sono stati utilizzati per confrontare il virus trovato negli esseri umani con quello trovato nei macachi di quel sito. Il colore dei cerchi accanto a ciascuno degli identificatori di BGH indica il ceppo SFV che è stato rilevato in questi esseri umani. Si noti che quattro dei soggetti sono stati infettati contemporaneamente da più ceppi di SFV e che alcuni individui sono stati infettati sia da un ceppo di SFV autoctono (originario dove trovato) sia da un ceppo simile a SFV trovato nei macachi di altre aree geografiche. nks, nessuna fonte nota. Visualizza a schermo intero Figura 1 Posizioni di campionamento e diversità dei ceppi di SFV rilevati in soggetti umani infettati da zoonosi. I soggetti umani sono stati intervistati e campionati in cinque siti urbani in tutto il Bangladesh dove i macachi rhesus erano liberi. Abbiamo recentemente dimostrato che in ciascuno di questi siti è possibile rilevare nei macachi un ceppo principale di SFV.15 Feeroz MM, Soliven K, Small CTet al. Emerg Microbes Infect2013;2:e29. [Taylor & Francis Online], [Google Scholar] I ceppi principali di Rhesus SFV sono codificati a colori su questa mappa. Per i soggetti umani (indicati con "BGH") che sono stati trovati infetti da SFV, abbiamo ottenuto più cloni da sangue intero e sequenziato una parte del gene gag SFV. I dati della sequenza sono stati utilizzati per confrontare il virus trovato negli esseri umani con quello trovato nei macachi di quel sito. Il colore dei cerchi accanto a ciascuno degli identificatori di BGH indica il ceppo SFV che è stato rilevato in questi esseri umani. Si noti che quattro dei soggetti sono stati infettati contemporaneamente da più ceppi di SFV e che alcuni individui sono stati infettati sia da un ceppo di SFV autoctono (originario dove trovato) sia da un ceppo simile a SFV trovato nei macachi di altre aree geografiche. nks, nessuna fonte nota. Sylhet Situata nella parte nord-orientale del paese, entro 35 km dal confine con la provincia indiana di Assam, Sylhet è la terza città più grande del Bangladesh. Una popolazione di circa 125 macachi si trova nel santuario di Shah Jalal nel centro della città. I macachi di Sylhet si estendono sul sito del santuario e nel quartiere immediatamente adiacente. I macachi di Shah Jalal sono regolarmente riforniti dal personale del santuario e spesso ricevono cibo dai visitatori del santuario. Hanno partecipato allo studio quattordici soggetti umani che vivono nei pressi del santuario. di cibo. Sebbene alcuni residenti di Bormi offrano occasionalmente cibo ai macachi, non esiste un approvvigionamento organizzato. Un totale di 105 soggetti umani di Bormi hanno partecipato a questo studio. Dhamrai La città di Dhamrai si trova a 40 km a sud-ovest di Bormi. Circa 75-100 macachi vivono liberamente attraverso Dhamrai. I macachi prediligono aree con grandi ombre e alberi da frutto, che si trovano più comunemente nei quartieri indù. Come a Bormi, non esiste un approvvigionamento organizzato di macachi. Nove soggetti di Dhamrai sono stati inclusi in questo set di dati.NarayanganjNarayanganj è una città portuale densamente popolata a circa 20 km a sud di Dhaka. La popolazione di macachi rhesus continua a diminuire in quest'area poiché lo sviluppo urbano sposta gli spazi verdi. I 60 macachi stimati in questa città non sono riforniti e non sono ben abituati agli umani. Trentasei soggetti umani di Narayanganj hanno partecipato allo studio.CharmaguriaCharmaguria si trova a 150 km a sud/sudovest di Dhaka lungo il fiume Padma. Gli oltre 200 macachi in quest'area sono riforniti da un'organizzazione locale in una posizione centrale e le abbondanti aree verdi in questa piccola città forniscono corridoi naturali lungo i quali gli animali si estendono ampiamente. Quarantacinque soggetti umani di Charmaguria hanno partecipato allo studio. Il reclutamento, il consenso informato e i protocolli di campionamento, incluso il follow-up di individui positivi a SFV, sono stati approvati dallo Human Subjects Review Board (23055) dell'Università di Washington e da un analogo comitato di revisione presso Università di Jahangirnagar, Bangladesh. I dati biologici e demografici di soggetti umani sono stati codificati con identificatori univoci e anonimi che iniziavano con "BanGladesh Human" (BGH). In ogni sito della comunità, i membri del team del Bangladesh hanno avviato contatti con i leader del quartiere e hanno identificato una posizione centrale all'interno della gamma dei macachi per la raccolta dei dati. I membri del team del Bangladesh hanno poi collaborato con i residenti della comunità e si sono spostati a ventaglio a piedi, chiedendo la partecipazione di persone che si sono identificate come morsi o feriti dai macachi. I criteri di inclusione per i soggetti includevano età superiore a 18 anni, esposizione auto-riferita a NHP e/o residenza a lungo termine (> 20 anni) nel villaggio. Il consenso informato scritto è stato ottenuto da tutti i soggetti. I dati demografici ei dati che descrivono le esposizioni a NHP sono stati acquisiti attraverso un questionario somministrato da un membro del team nella lingua locale, il bengalese. Dieci millilitri di sangue intero sono stati raccolti dalla vena antecubitale di ciascun soggetto in un tubo contenente acido etilendiamminotetraacetico, conservato in ghiaccio per non più di 12 ore, quindi centrifugato. Le aliquote di sangue intero e plasma sono state conservate a -80 °C fino all'analisi. I tamponi Whatman Sterile Omni (Whatman, Piscataway, NJ, USA) sono stati utilizzati per acquisire campioni di mucosa buccale. I tamponi sono stati immediatamente posti in 500 µl di Qiagen Buffer RLT (Qiagen, Valencia, CA, USA) raffreddati in ghiaccio per non più di 12 ore prima di essere congelati a -80 °C fino all'analisi. Questi metodi sono essenzialmente identici a quelli che abbiamo usato per acquisire e conservare campioni biologici derivati ​​da macachi.15 Feeroz MM, Soliven K, Small CTet al. Dinamiche di popolazione di macachi rhesus e virus schiumosi associati in Bangladesh. Emerg Microbes Infect2013;2:e29. [Taylor & Francis Online], [Google Scholar]Ripetere il campionamento di umani confermati positivi per SFV Se un soggetto umano è stato confermato positivo per SFV mediante reazione a catena della polimerasi (PCR), il team di ricerca ha tentato di contattare e ricampionare il soggetto circa 1 anno dopo il campionamento iniziale . I protocolli di raccolta del campione biologico per il campionamento di follow-up dei soggetti positivi per SFV sono stati gli stessi utilizzati durante il campionamento iniziale. Inoltre, i soggetti positivi all'SFV hanno ricevuto un breve esame fisico ed è stata raccolta un'anamnesi medica approfondita. Emerg Microbes Infect2013;2:e29. [Taylor & Francis Online], [Google Scholar] fornisce tutti i campioni di animali e i protocolli di laboratorio. Le sequenze di bavaglio SFV da un totale di 184 macachi rhesus sono incluse nel presente studio (Figura 2). Includiamo anche in questo dataset sequenze ottenute da quattro rhesus, due da Dhamrai e due da Bormi, che siamo stati in grado di ricampionare due anni dopo il loro campionamento iniziale. Il virus schiumoso delle scimmie zoonotiche in Bangladesh riflette diversi modelli di trasmissione e coinfezione Tutti gli autoriGregory A Engel, Christopher T Small, Khanh Soliven, Mostafa M Feeroz, Xiaoxing Wang, M Kamrul Hasan, Gunwha Oh, SM Rabiul Alam, Karen L Craig, Dana L Jackson, Frederick A Matsen IV, Maxine L Linial e Lisa Jones-Engelhttps://doi.org/10.1038/emi.2013.60Pubblicato online: 25 gennaio 2019Figura 2 Classificazioni dei ceppi di sangue per le scimmie da popolazioni campionate. Per ogni scimmia, in (A) è presentata una barra di colore corrispondente alla popolazione campione di scimmie e in (B) tessere colorate corrispondenti ai ceppi osservati all'interno del campione di sangue di quella scimmia. I ceppi non core sono etichettati in base alle relazioni ricombinanti stabilite con i ceppi parentali. Le corrispondenze positive sono definite da almeno il 90% di probabilità per 200 o più coppie di basi contigue in un'analisi cBrother. Le regioni del genoma corrispondenti a nessun ceppo parentale al di sopra di questa soglia per almeno 200 nt sono state contrassegnate come nks (nessuna fonte nota). Questa è una versione semplificata di una figura del documento associato a questo studio,15 Feeroz MM, Soliven K, Small CTet al. Dinamiche della popolazione dei macachi rhesus e del virus schiumoso associato in Bangladesh. Emerg Microbes Infect2013;2:e29. [Taylor & Francis Online], [Google Scholar] ma con classificazioni dei ceppi aggiornate.Visualizza a schermo interoFigura 2 Classificazioni dei ceppi di sangue per le scimmie da popolazioni campionate. Per ogni scimmia, in (A) è presentata una barra di colore corrispondente alla popolazione campione di scimmie e in (B) tessere colorate corrispondenti ai ceppi osservati all'interno del campione di sangue di quella scimmia. I ceppi non core sono etichettati in base alle relazioni ricombinanti stabilite con i ceppi parentali. Le corrispondenze positive sono definite da almeno il 90% di probabilità per 200 o più coppie di basi contigue in un'analisi cBrother. Le regioni del genoma corrispondenti a nessun ceppo parentale al di sopra di questa soglia per almeno 200 nt sono state contrassegnate come nks (nessuna fonte nota). Questa è una versione semplificata di una figura del documento associato a questo studio,15 Feeroz MM, Soliven K, Small CTet al. Dinamiche della popolazione dei macachi rhesus e del virus schiumoso associato in Bangladesh. Emerg Microbes Infect2013;2:e29. [Taylor & Francis Online], [Google Scholar] ma con classificazioni dei ceppi aggiornate. Rilevamento SFV Western blot Fibroblasto di macaco rhesus Linea cellulare Telo-RF 19Kirchoff V, Wong S, St JS, Pari GS. Generazione di una linea cellulare di fibroblasti di scimmia rhesus espansa in vita per la crescita del rhesus rhadinovirus (RRV). Arch Virol2002;147:321-333. [Crossref], [Google Scholar] è stato infettato da SFV M. mulatta o M. fascicularis, o lasciato non infetto. Dopo 48 ore, le cellule sono state lisate in 1 × tampone campione di sodio dodecil solfato (50 mM Tris-HCl (pH 6.8), 10% glicerolo, 2% sodio dodecil solfato, 5% 2-mercaptoetanolo, 0.01% blu di bromofenolo) e campioni elet troforato con gel di poliacrilammide al 10%. Dopo il trasferimento delle proteine ​​alle membrane di polivinilidendifluoruro (Millipore Billerica, MA, USA), le membrane sono state bloccate in soluzione salina tamponata con fosfato + 0.05% di Tween-20 contenente il 2% di latte in polvere scremato, e risciacquate con acqua e lasciate asciugare. Sono state realizzate strisce, ciascuna contenente tre corsie (marcatore di peso molecolare, Telo-RF non infetto e lisati di cellule Telo-RF infette) e l'anticorpo primario (plasma umano) è stato aggiunto a una diluizione di 1/20 e incubato per una notte a 4 ° C. Le strisce sono state lavate tre volte in soluzione salina tamponata con fosfato + Tween-0.05 allo 20% prima di aggiungere perossidasi di rafano anti-umano di capra (Thermo Scientific e GE Healthcare Rochester, NY, USA) a una diluizione di 1∶5000 per 1 ora a temperatura ambiente . Le strisce sono state lavate altre tre volte prima di risciacquare con acqua e applicare un substrato stabilizzato con 3,3′,5,5′-tetrametilbenzidina per perossidasi di rafano (Promega Madision, WI, USA) per visualizzare le bande. Plasma da BGH4, un noto SFV umano positivo20Jones-Engel L, May CC, Engel GAet al.Diversi contesti di trasmissione zoonotica di virus schiumosi scimmieschi in Asia. Emerg Infect Dis2008;14:1200-1208. [Crossref], [Google Scholar] è stato utilizzato come controllo positivo. Isolamento del DNA da sangue intero Il DNA genomico totale è stato estratto dal sangue intero di esseri umani utilizzando il kit QIAamp DNA blood mini (Qiagen) secondo il protocollo del produttore. Abbiamo estratto il DNA da 200 µl di sangue intero. Il DNA purificato è stato eluito in 200 µL di tampone AE. Amplificazione PCR di frammenti gag e pol dal DNA genomico Un totale di 15 µL del DNA isolato è stato utilizzato per l'amplificazione PCR di frammenti gag o pol mediante una PCR a due round. La prima fase di PCR era una reazione multiplex con primer sia gag che pol (sequenza primer: G1 (+) (nt 114-134, presa dalla sequenza SFV1 GeneBank NC_001364 NC_001736) 5′-AGG ATG GTG GGG ACC AGC TA-3′; G2 (-) (nt 1451–1433) 5′-CAG GAA GAG GTA CTC GGG G-3′; P1 (+) (nt 5179–5200) 5′-GCC ACC CAA GGA AGT TAT GTG G-3′; P2 ( −) (nt 5768–5749) 5′-GCT GCC CCT TGG TCA GAG TG)-3′. Le reazioni sono state denaturate a 95 °C per 3 min, seguite da due cicli di 95 °C per 30 s, 38 °C per 1 min, 72 °C per 1 min, quindi seguiti da 25 cicli di 95 °C per 30 s , 52°C per 1 min e 72°C per 1 min. L'acqua è stata utilizzata come controllo negativo. 2 µl del prodotto PCR sono stati utilizzati come modello per la seconda PCR rotonda. Primer gag o pol (G3 (+) (nt 190–212) 5′-CAA CCT AGA TGG AGA GCT GAA GG-3′; G4 (-) (nt 1425–1406) 5′-GGG GAC AAA CTA CGG CTG GG-3′; P5 (+) (nt 5339–5361) 5′-TAA TCC TCC AGG GTA TCC AAA A-3′; P6 (-) (nt 5728–5707) 5′-ATA CCA TCG ACT ACT ACA AGG A-3′) sono stati utilizzati per amplificare singoli frammenti. Le reazioni sono state denaturate a 95 °C per 3 min, seguite da 35 cicli di 95 °C per 30 s, 52 °C per 1 min e 72 °C per 1 min. Le dimensioni previste dei prodotti PCR per gag e pol sono rispettivamente di 1235 bps e 390 bps. Clonazione e sequenziamento di frammenti di gag I prodotti FV PCR sono stati purificati su gel utilizzando un kit di estrazione rapida in gel QIA (Qiagen) secondo il protocollo del produttore. I frammenti purificati sono stati ligati nel vettore di clonazione TOPO-TA (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) e trasformati in cellule competenti di Escherichia coli TOP10 (Invitrogen). Sono state selezionate più singole colonie per ciascun campione di bavaglio e il DNA plasmidico è stato purificato e sequenziato. Il sequenziamento è stato effettuato utilizzando primer diretti e inversi M13, nonché primer interni diretti e inversi per il bavaglio dalla University of Washington Genomics Facility o GeneWiz Inc. (Seattle, WA, Stati Uniti). I ceppi virali sono indicati utilizzando lettere minuscole per distinguerli dai siti geografici in cui sono stati campionati gli esseri umani o i macachi (ad esempio, Dhamrai è un sito di studio in cui è stato rilevato il ceppo del nucleo di dhamrai). (Qiagen) sono stati scongelati a 37 ° C per 15 minuti con 40 U dell'inibitore della ribonucleasi RNaseOUT (Invitrogen) e 1 U di DNasi I senza RNasi (Promega) immediatamente prima dell'estrazione dell'RNA. L'RNA totale è stato estratto secondo il protocollo standard utilizzando il RNeasy Mini Kit (Qiagen). L'RNA è stato trattato nuovamente con 40 U di RNaseOUT e 1 U di DNasi I priva di RNasi a 37 ° C per 1 h. I campioni sono stati quindi incubati a 65 ° C per 15 minuti per inattivare gli enzimi. L'RNA è stato conservato a -20 ° C per un uso successivo. La PCR di trascrizione inversa (RT-PCR) del tampone buccale RNART-PCR è stata eseguita per clonare sequenze parziali di bavaglio (1235 bp) dall'RNA del tampone buccale. Il cDNA del primo filamento è stato sintetizzato utilizzando il sistema Thermoscript RT-PCR (Invitrogen) secondo il protocollo del produttore utilizzando un primer Oligo(dT)18. Le reazioni RT sono state inattivate a 85 °C per 5 min. I cDNA risultanti sono stati utilizzati come modello per due round PCR come descritto sopra per l'amplificazione del bavaglio FV del sangue intero. Un'analisi approfondita di questa attività è presentata in Matsen et al. (Inedito). Questa analisi ha prodotto allineamenti di sequenze negative di presunta ipermutazione rimuovendo le colonne sospettate di ipermutazione. Questi allineamenti sono stati utilizzati per il resto delle analisi in questo studio, al fine di evitare la fusione di ipermutazione e genuino segnale filogenetico. calcolo di grandi alberi di evoluzione minima con profili invece di una matrice di distanza. Mol Biol Evol2009;26:1641-1650. [Crossref], [Web of Science ®], [Google Scholar],22Price MN, Dehal PS, Arkin AP.FastTree 2: alberi con probabilità massima approssimativa per grandi allineamenti. PLoS ONE2010;5:e9490. [Crossref], [Web of Science ®], [Google Scholar] Questo albero è stato visualizzato utilizzando Archaeopteryx (https://sites.google.com/site/cmzmasek/home/software/archaeopteryx). Dallo stesso allineamento, SplitsTree 4.12.823Huson DH, Bryant D. Applicazione delle reti filogenetiche negli studi evolutivi. Mol Biol Evol2006;23:254–267. [Crossref], [Web of Science ®], [Google Scholar] è stato utilizzato per produrre una rete di suddivisioni. È stato riscontrato che una singola applicazione di UCLUST v1.124Edgar RC.Search e raggruppa ordini di grandezza più velocemente di BLAST. Bioinformatica2010;26:2460-2461. [Crossref], [Web of Science ®], [Google Scholar] hanno prodotto risultati di clustering scadenti a causa della natura avida dell'algoritmo. È stato implementato un algoritmo iterativo di ricentramento, suggerito dall'autore di UCLUST su http://drive5.com/usearch/manual/recenter.html, che ha affrontato bene questo problema. Per ogni round di clustering, le sequenze di consenso del round precedente sono state aggiunte alla parte superiore di un allineamento ungapped, in ordine di dimensione del cluster dal più grande al meno. Per questa iterazione, il clustering è stato effettuato utilizzando cluster_smallmem, producendo nuove sequenze e cluster di consenso. Questo processo è stato ripetuto due volte. Le assegnazioni dei cluster sono state ulteriormente perfezionate da uno script che ha trovato il vero centroide di ciascun cluster, come definito dalla sequenza con distanza Hamming media normalizzata minima da ogni altra sequenza nel cluster. Lo script è stato quindi controllato per assicurarsi che ogni sequenza fosse raggruppata con il centroide a cui era più vicina (di nuovo, come definito dalla distanza di Hamming normalizzata), effettuando le riassegnazioni secondo necessità. Questo algoritmo iterativo è stato applicato utilizzando una soglia del 97.77%. Questa soglia, sebbene leggermente superiore a quella utilizzata nel nostro studio associato,15 Feeroz MM, Soliven K, Small CTet al. Dinamica della popolazione dei macachi rhesus e del virus schiumoso associato in Bangladesh. Emerg Microbes Infect2013;2:e29. [Taylor & Francis Online], [Google Scholar] riflette meglio la quantità leggermente inferiore di diversità di sequenza a seguito della rimozione delle colonne sospettate di ipermutazione. Come accennato in precedenza, i ceppi virali sono indicati utilizzando lettere minuscole per distinguerli dai siti geografici in cui sono stati campionati gli esseri umani o i macachi (ad esempio, Dhamrai è un sito di studio in cui è stato trovato principalmente il ceppo del nucleo di dhamrai). Metodi statistici L'analisi statistica delle variabili demografiche è stata eseguito utilizzando il pacchetto software statistico JMP (SAS Institute, Cary, NC, USA); l'analisi delle tabelle di contingenza è stata eseguita con la funzione R fisher.test.25 R Core Team. R: linguaggio e ambiente per l'elaborazione statistica. Vienna: R Foundation for Statistical Computing, 2012. [Google Scholar]RISULTDSDati demografici comprese le esposizioni a NHPIn un periodo di 5 anni, 2007-2011, sono stati raccolti campioni biologici da 222 persone.

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